小檗堿對糖尿病大鼠認知功能改善及對Notch1和Hes1蛋白表達的影響

摘要：目的:研究小檗堿對糖尿病大鼠空間學習記憶障礙的改善作用以及糖尿病大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡影響。 方法:制備STZ誘導的糖尿病大鼠模型，以60 mg/kg劑量的小檗堿治療6周，檢測其體重和空腹血糖水平,Morris水迷宮 實驗評價大鼠學習記憶能力；尼氏染色觀察大鼠海馬區(qū)病理改變;TUNEL染色檢測大鼠海馬神經(jīng)元凋亡;Western Blot檢 測海馬中Caspase3、Bcl-2、Notch1和Hes1蛋白的表達水平。結果：與模型組相比，小檗堿降低糖尿病大鼠血糖『27. 53 ?.69) v.s. (26. 81 ?.07) mmol/L,P>0. 05],但無統(tǒng)計學差異；小檗堿改善糖尿病大鼠空間記憶障礙（P <0.05);小 檗堿干預后，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞排列緊密,細胞形態(tài)清晰，正常形態(tài)細胞明顯增多；小檗堿降低海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡 水平（P <0.05),小檗堿組鼠大腦海馬組織中Notch信號通路相關蛋白Hes1水平相對于模型組組均明顯降低（P< 0.05)。結論:小檗堿調(diào)節(jié)海馬組織中Notch1和Hes1蛋白而改善糖尿病大鼠認知功能障礙。

關鍵詞：小檗堿;糖尿病大鼠;認知功能;神經(jīng)元;凋亡

糖尿病腦病（diabetic encephalopathy, DE)是以認 知功能障礙為主要特點的糖尿病并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為 學習記憶能力的減退和空間定向困難。DE的發(fā)病機制十分復雜，目前有多種解釋都集中于高血糖或血糖 波動狀態(tài)介導的氣化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥反應等 多因素誘導海馬神經(jīng)元凋亡從而導致DE¹。DE與阿 爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD)患者有著類似的 臨床表現(xiàn)，并且相似的病理改變，如腦內(nèi)淀粉樣肽的生 成、腦內(nèi)炎癥和氣化應激反應² ,有研究表明³糖尿病 患者有更高的風險患有AD。并且DE所引起的認知 功能障礙起病時比較隱匿，因此，深入研究DE的早期 防治措施，對DE的預防和治療具有重要意義。

小檗堿為異喹啉類生物堿化合物，臨床上主要用于 治療胃腸道疾病，還具有抗心律失常、抗高血壓、抗心力 衰竭、抗炎、抗腫瘤的作用。本文主要探討小檗堿對DE 大鼠認知障礙的改善作用及神經(jīng)保護作用機制。

• 實驗材料
  • 儀器與試劑 LEICACM1950冰凍切片機（德國 萊卡），熒光顯微鏡（日本奧林巴斯BX61) , Morris水迷 宮（上海欣軟），鏈脈佐菌素（STZ) (Cayman Chemical 公司）；細胞凋亡檢測試劑盒（TUNEL) (Cell Signaling 科技有限公司）蘇木精、伊紅、二甲苯、95 %_c乙醇等均 為國產(chǎn)試劑。

• 2 實驗動物清潔級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量 170 ~200 g,由遼寧省實驗動物中心提供，合格證號為 SCXK(遼）2015 - 0001 (遼寧長生生物技術有限公 司），動物單籠喂養(yǎng)，自由攝食攝水。

• 討論

  小檗堿對糖尿病并發(fā)癥以及對多種認知障礙動物 模型發(fā)揮藥理作用^4-9。Morris水迷宮實驗驗證了 6 周糖尿病大鼠的出現(xiàn)認知障礙；與糖尿病組比較，小檗 堿治療的大鼠顯著縮短了尋找隱藏平臺的時間和路 程，表明小檗堿可以改善糖尿病大鼠的空間學習記憶 障礙。

  海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)構成記憶回路的重要結 構，在學習、記憶和內(nèi)臟活動中發(fā)揮重要作用。小檗堿 能透過血腦屏障直接作用于皮層和海馬神經(jīng)元^[10]。 尼氏染色實驗結果顯示，與模型組比較，小檗堿組大鼠 海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)有所改善。TUNEL與NeuN染 色實驗表明，與模型組比較，小檗堿組降低了海馬齒狀

  回顆粒細胞下層中凋亡細胞的比例。

  I型糖尿病大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡導致神經(jīng) 細胞密度降低，并與其認知功能障礙有關^[11]。Caspase 是一切凋亡信號轉(zhuǎn)導的共同通路一旦被激活，凋亡常 難以避免^[12] , Bcl -2作為Bcl -2家族抑制凋亡成員 之_。小檗堿能抑制糖尿病大鼠海馬組織中Caspase -3表達的升高，同時降低Bcl -2表達，以上結果提 示小檗堿能夠抑制糖尿病大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，具 有_定的神經(jīng)保護作用。

  Notch信號通路在神經(jīng)元發(fā)育成熟、神經(jīng)再生以 及神經(jīng)元凋亡方面以及神經(jīng)行為的建立和神經(jīng)退行性 病變也有著密切的聯(lián)系^[13]。通過對Alzheimer?s患者 腦部海馬區(qū)域的Notch 1表達增高^[14]。在缺血再灌注 組動物腦內(nèi)Notch 1受體數(shù)目表達增加，而Notch信號 激活T淋巴細胞并使細胞炎性因子釋放增多，終介 導了神經(jīng)元的損傷^[15]。本研究結果顯示，小檗堿可以 顯著下調(diào)Notch - 1和及相關蛋白Hes1的表達，小檗 堿可能通過抑制異常活化的Notch通路，進而阻止受 損的神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮保護作用。關于Notch信號通 路在DE中的作用目前還不十分明確，但以上結果表 明，Notch1異常對其病理發(fā)展及治療具有重要的意 義。小檗堿降低糖尿病大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，主 要通過調(diào)節(jié)Notch1和Hes1表達而發(fā)揮藥理作用。