1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF 級(jí)健康成年Sprague Dawley ( SD) 雄性大鼠82 只，鼠齡8 周，體質(zhì)量180 ～ 200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK( 京) 2016－ 0011。正常飲食，實(shí)驗(yàn)環(huán)境清潔，溫度25 ℃，晝夜交替12 h，飼養(yǎng)1 周以適應(yīng)環(huán)境，每籠2 ～ 3 只。本實(shí)驗(yàn)通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)( 倫理批號(hào): AEEI-2018－017) 。東莨菪堿對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳行為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響及其作用靶點(diǎn)
1. 2 主要藥品及試劑
微量給藥套管購自瑞沃德公司; 微量進(jìn)樣針購自上海高鴿公司; Scopolamine hydrobromide 購自英國Tocris 公司( 批號(hào): 114－49－8) ; Methoctramine hydrate ( 批號(hào): 104807－46－7) 和Muscimol hydrobromide( 批號(hào): 18174 － 72 － 6) 購自美國Sigma 公司。東莨菪堿對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳行為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響及其作用靶點(diǎn)
1. 3 主要儀器
東莨菪堿對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳行為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響及其作用靶點(diǎn)強(qiáng)迫游泳有機(jī)玻璃缸( 水深37 cm，桶高50 cm，直徑30 cm) 購自武漢普百康科技發(fā)展有限公司。大鼠強(qiáng)迫游泳分析軟件EthoVisionXT10 購自荷蘭Noduls公司。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)( 100 cm × 100 cm × 40 cm，底部為黑色，四周壁為黑色，無蓋不透明塑料方箱) 購自上海欣軟信息科技有限公司。
1. 4 實(shí)驗(yàn)方法
1. 4. 1 動(dòng)物分組及處理
1) 通過強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)明確東莨菪堿的抗抑郁樣作用: 將14 只正常SD 大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為東莨菪堿組和對(duì)照組，每組7 只，分別腹腔注射25 μg /kg 東莨菪堿或等體積0. 9% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射液，24 h 后通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)東莨菪堿對(duì)大鼠抑郁樣行為的影響。東莨菪堿對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳行為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響及其作用靶點(diǎn)
2) 利用γ-氨基丁酸-A ( γ-aminobutyric acid-A，GABA-A) 受體激動(dòng)劑蠅蕈醇( Muscimol) 沉默內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)( medial prefrontal cortex，mPFC) 神經(jīng)元以明確東莨菪堿發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的腦區(qū): 將14 只正常SD大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為Muscimol + 東莨菪堿組和東莨菪堿組，每組7 只，在腹腔注射25 μg /kg 東莨菪堿前1 h 分別向大鼠mPFC 立體定位注射Muscimol1. 25 μg 或等體積0. 9% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射液，24 h 后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察東莨菪堿的行為學(xué)效應(yīng)是否被阻斷。

3) 通過M2受體選擇性拮抗劑MCT 側(cè)腦室注射以明確M2受體是東莨菪堿抗抑郁的作用靶點(diǎn): 將大鼠分為對(duì)照組和MCT 組，分3 批次分別向大鼠側(cè)腦室注射0. 5 μg / 2 μL( 對(duì)照組和MCT 組各9 只) 、1 μg /2 μL( 對(duì)照組7 只，MCT 組10 只) 和2 μg /2 μLMCT( 對(duì)照組9 只，MCT 組10 只) ，對(duì)照組均給予2 μL0. 9%( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射液。24 h 后利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠行為學(xué)變化。東莨菪堿對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳行為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響及其作用靶點(diǎn)
1. 4. 2 手術(shù)和給藥
動(dòng)物稱體質(zhì)量后，用1% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 比妥溶液0. 5 mL /100 g腹腔注射麻醉。根據(jù)大腦立體定位圖譜將套管埋置于雙側(cè)mPFC( 前囟前2. 8 mm，旁開3. 1 mm，深度3. 8mm，傾斜30°角) 或者側(cè)腦室( 前囟后0. 9mm，旁開1. 5 mm，深度3. 5 mm) 。大鼠術(shù)后休息1 周后，通過微量給藥系統(tǒng)經(jīng)套管向雙側(cè)mPFC 注射Muscimol 或等體積0. 9% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射液，向雙側(cè)側(cè)腦室注射不同劑量MCT 或2 μL 0. 9%( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射液，給藥速度均為0. 2 μL /min，給藥后留針5 min。東莨菪堿對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳行為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響及其作用靶點(diǎn)
1. 4. 3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)
用來評(píng)定大鼠自發(fā)性活動(dòng)能力。提前將大鼠搬入測(cè)試室，使大鼠適應(yīng)環(huán)境至少1 h。將大鼠放入曠場(chǎng)設(shè)備中心后，開始記錄5 min 內(nèi)大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)總路程，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束用稀釋的乙醇*清潔曠場(chǎng)。測(cè)試過程采用SuperMaze視頻記錄分析軟件( 上海欣軟信息科技有限公司)記錄并分析。東莨菪堿對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳行為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響及其作用靶點(diǎn)

1. 4. 4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)
用來評(píng)價(jià)大鼠的絕望行為，是評(píng)價(jià)大鼠抑郁樣行為的重要指標(biāo)。于正式實(shí)驗(yàn)前24 h 將測(cè)試大鼠放入25 ℃水中，室溫25 ℃，大鼠懸浮四肢不能觸及桶底，15 min 后將大鼠取出、擦干后放回籠中; 次日在同樣的條件下進(jìn)行強(qiáng)迫游泳5 min，記錄5 min 內(nèi)大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間( 大鼠僅有頭部露出水面，身體飄浮在水中，四肢可有微動(dòng)但不掙扎) ，測(cè)試過程采用攝影機(jī)記錄。
2 討論
近年來，東莨菪堿的快速抗抑郁治效果已被多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，東莨菪堿對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳行為和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響及其作用靶點(diǎn)作用機(jī)制至今仍不清楚。作為M 受體的非選擇性拮抗劑，東莨菪堿與M1 ～ M5 5 種M受體亞型均可結(jié)合，如能找到介導(dǎo)東莨菪堿抗抑郁作用的具體靶點(diǎn)，將對(duì)于研發(fā)快速起效抗抑郁藥具有重要意義。
    SuperFst強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)分析軟件